Alternativamente, os jogadores assumem o papel de um dos 34 assassinos, O Caçador, O Espectro, O Caipira, A Enfermeira, O Vulto, A Bruxa, O Médico, A Caçadora, O Canibal, O Pesadelo, A Porca, O Palhaço, O Espírito, A Legião, A Praga, O Ghostface, O Demogorgon, O Oni, O Mercenário, O Carrasco, O Flagelo, Os Gêmeos, O Trapaça, O Nemesis, O Cenobita, A Artista, A Onryō, A Draga, O Vilão, O Cavaleiro, a Negociante de Crânios, a Singularidade, o Xenomorfo e o Cara Legal. A maioria dos assassinos tem apenas uma forma de locomoção, movendo-se em ritmo acelerado, o que é moderadamente mais rápido do que o ritmo de um sobrevivente correndo. Ao caçar os sobreviventes, o assassino deve capturá-los ou golpeando-os duas vezes com a arma (o primeiro golpe reduz o estado de vida do sobrevivente de "saudável" para "ferido" e empurra-os a uma curta distância à frente do assassino, enquanto o segundo golpe os leva ao estado "morrendo", onde o sobrevivente rasteja lentamente no chão) ou agarrá-los em certos movimentos, pegá-los dentro de armários, enquanto tentam saltar sobre barricada ou através de janelas, enquanto consertam um gerador, ou tentam resgatar um sobrevivente um gancho. Alguns assassinos têm ataques secundários que causam dano duplo e colocam os sobreviventes no estado "morrendo" em apenas um ataque. Todo assassino tem uma habilidade secundária, chamada de "poder". Cada poder é único. Por exemplo, o Espectro pode se tornar invisível e se mover mais rápido ao tocar seu sino (mas incapaz de atacar os sobreviventes enquanto estiver oculto), e o Caipira usa uma motosserra que permite que ele corra rapidamente pelo mapa e derrube sobreviventes instantaneamente com ela. Os poderes podem ser melhorados usando complementos que são comprados na teia de sangue.
O objetivo do assassino é sacrificar os sobreviventes à Entidade, um ser malévolo que domina o reino em que Dead by Daylight ocorre. Sobreviventes presos são colocados em ganchos de açougue localizados ao longo do território da partida, o que inicia o processo de sacrifício, que levará dois minutos para ser concluído sem qualquer influência externa. Alguns complementos especiais, vantagens ou as oferendas chamadas ‘Memento Mori‘ permitem que o assassino pule o processo de sacrifício e mate um sobrevivente diretamente com as próprias mãos, com uma animação especial.
Na primeira vez que um sobrevivente é enganchado, ele entra na primeira fase. Nesta fase, o sobrevivente pode tentar uma chance baixa (de 4%) de escapar do gancho por conta própria ao custo de acelerar tremendamente o processo de sacrifício para a segunda fase por falha em escapar. Sobreviventes enganchados também podem ser resgatados por outros sobreviventes. Oferendas e vantagens específicas podem aumentar a chance de escapar do gancho sozinho. Se o sobrevivente escapa ou é salvo e, eventualmente, é enganchado pela segunda vez, ele entra na ‘fase de luta’, na qual o sobrevivente tem que resistir à Entidade tentando apunhalá-los acertando os testes de perícia contínuos que vão se diminuindo com o passar do tempo, até que sejam salvos por um aliado ou mortos pela ‘Entidade’. Se o sobrevivente for salvo durante a ‘fase de luta’ e for enganchado pela terceira vez, ele morrerá para a Entidade instantaneamente sem oportunidade de sobrevivência.
O assassino, apesar de andar mais rápido que os sobreviventes, é mais lento do que os sobreviventes na maioria dos outros movimentos: depois de atingir um sobrevivente, o assassino diminuirá a sua velocidade de movimento para limpar o sangue de sua arma. O assassino também é mais lento em saltar janelas e não pode pular sobre paletes que os sobreviventes podem lançar em seu caminho (com exceção da Legião e o Vilão), em vez disso os assassinos têm que rodear o local ou gastar algum tempo destruindo-as.
O assassino também tem uma habilidade de leitura de aura, revelando constantemente a localização de geradores, totens enfeitiçados e, ao carregar um sobrevivente, ganchos através do mapa. Um mecanismo foi adicionado no Patch 1.5.0, que introduziu a mecânica ‘Sede de Sangue’. Durante 15 segundos em uma perseguição sem usar o poder, quebrar ou ser atordoado por paletes ou atacar um sobrevivente, o assassino recebe um impulso de 0,2 m/s à sua velocidade de movimento base; 30 segundos em uma perseguição concede ao assassino um aumento de 0,4 de m/s; e finalmente, se uma perseguição durar 45 segundos consecutivos, o assassino recebe um impulso de 0,6 m/s. A sede de sangue dura apenas até que uma perseguição termine ou até o assassino realizar algumas das ações citadas.