Como asesino, los jugadores pueden asumir el papel de Evan MacMillan (El Trampero); Philip Ojomo (El Espectro); Max Thompson Jr. (El Pueblerino); Sally Smithson (La Enfermera); Michael Myers (La Forma);9 Lisa Sherwood (La Bruja); Herman Carter (El Doctor); Anna (La Cazadora); Leatherface (El Caníbal);9 Freddy Krueger (La Pesadilla);9710 Amanda Young (La Cerda),9 Jeffrey Hawk (El Payaso), Rin Yamaoka (El Espíritu), Frank, Susie, Julie o Joey (La Legión), Adiris (La Plaga), Danny Johnson (Ghostface), El Demogorgon, Kazan Yamaoka (El Oni); Caleb Quinn (El Arponero), Pyramid Head (El Verdugo), Talbot Grimes (El Deterioro), Victor y Charlotte Deshayes (Los Gemelos), Ji-Woon Hak (El Traicionero), Nemesis T-Type (Némesis), Pinhead (El Cenobita), Carmina Mora (La Artista), Sadako Yamamura (Onryō), The Dredge, Albert Wesker (La Mente Maestra), Tarhos Kovács (Knight), Adriana Imai (La Comerciante de Calaveras), HUX-A7-13 (La Singularidad), Xenomorfo (Alien) y Chucky (El Chico Bueno), todos con habilidades únicas.611 El asesino no puede correr o agacharse (a excepción de Amanda y Ghostface, que pueden agacharse), sino que simplemente camina a un ritmo muy rápido, que es ligeramente más rápido que el ritmo de un superviviente. Al cazar a los supervivientes, el asesino debe capturarlos golpeándolos dos veces con su arma (el primer golpe deja al sobreviviente herido con problemas al caminar, mientras que el segundo golpe los deja arrastrándose por el suelo), o puede agarrarlos de una vez atrapándolos dentro de los casilleros, mientras intentan saltar sobre plataformas o ventanas, mientras reparan un generador, intentan salvar a un compañero superviviente en un gancho o intentan escapar a través de una trampilla. Algunos asesinos tienen un ataque secundario que reduce a un superviviente directamente en el suelo.
El asesino puede matar inicialmente a los sobrevivientes colgándolos en uno de los muchos ganchos de carne en el área y esperando que las garras de El Ente finalmente terminen con el sobreviviente, llevando su alma a la niebla. Sin embargo, después de que un jugador haya ganado suficientes puntos de experiencia como asesino, se pueden desbloquear ciertas ofrendas de un solo uso llamados ‘Memento Mori’ que incluyen la habilidad matar a los sobrevivientes con sus propias manos una vez que hayan sido colgados dos veces. El asesino también puede matar a los sobrevivientes dejándolos en el suelo y esperando que se desangren hasta la muerte, o, en el caso de La Cerda, los sobrevivientes también pueden ser asesinados por las trampas de invertidas que coloca sobre sus cabezas.
La primera vez que un sobreviviente queda enganchado, ingresa a una primera fase. Solo en esta fase, el jugador puede intentar, con una probabilidad baja (4%), escapar del gancho a costa de acelerar su muerte si no escapa debido a la "salud de gancho" (en su totalidad, otorgando hasta tres oportunidades). Los jugadores también pueden ser rescatados por otros sobrevivientes. Si el jugador escapa o es salvado y se engancha por segunda vez, entrará en el estado de lucha, en el que el jugador tiene que resistirse a El Ente que intenta apuñalarlo, acertando las pruebas de habilidad que saldrán hasta que lo salva otro sobreviviente o El Ente lo sacrifique. Si el jugador se salva durante el estado de lucha y se engancha por tercera vez, morirá instantáneamente sin oportunidad de sobrevivir.
El asesino, a pesar de caminar a un ritmo rápido, es más lento al realizar otros movimientos: después de golpear a un jugador, el asesino sufrirá ralentización para limpiar la sangre de su arma. El asesino también es más lento al saltar por las ventanas, y no puede saltar sobre los pallets que los sobrevivientes pueden poner en su camino (a excepción de La Legión y Albert Wesker, que tienen habilidades secundarias que se los permiten), pero puede pasar una gran cantidad de tiempo destruyendo las barricadas. El asesino también tiene una capacidad de lectura de aura similar a la de los sobrevivientes, sólo que el asesino lo puede usar para ver las ubicaciones de cada generador, tótem y gancho en el mapa. También se agregó una nueva mecánica en la actualización 1.5.0 que introdujo la sed de sangre. Pasados 15 segundos en una persecución, el asesino recibe un impulso de 0.2 m/s; 25 segundos en una persecución le da al asesino un impulso de 0.6 m/s; y finalmente, si una persecución dura 35 segundos, el asesino obtiene un aumento de 1.2 m/s. Estos efectos solo duran hasta que finaliza una persecución en la que los efectos bajan un 10% por segundo sin perseguir a un sobreviviente, un pallet se rompe y cuando un sobreviviente es golpeado. Esto se agregó para evitar el abuso de la mecánica conocida como "looping", que es cuando un sobreviviente corre alrededor de pallets o estructuras durante un período prolongado de tiempo para que el resto del equipo pueda completar generadores y, en cambio, anima al sobreviviente a romper la línea de visión y escapar por completo del asesino.
Al igual que los sobrevivientes, los asesinos tienen aspectos legendarios que les dan la apariencia de otros personajes, como es el caso de Chatterer (Pinhead) y Tiffany Valentine (Chucky).